外源基因的細胞株初始培養

293細胞比較容易轉染，是一個很常用的表達研究外源基因的細胞株。液氮罐

293細胞的一個衍生株：293T/17的轉染效率更高，成為廣大研究者研究基因功能的一個強大工具。293細胞的缺陷是生長過程中貼壁強度比較小。所以在實驗過程中容易流失，從而影響實驗結果。如果一個實驗室新得到的293細胞是郵寄得到的并且細胞在培養瓶中，就需要讓細胞沉降幾天時間，因為大量細胞會漂浮在培養液里。

293細胞系是原代人胚腎細胞轉染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化細胞，表達轉染的腺病毒5的基因。

來源：人體腎臟 形態：上皮細胞 生長特性：貼壁 注釋：該細胞含腺病毒5 DNA 。

培養液： MEM( 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉)， 10% 馬血清(熱滅活)。

傳代： 吸去培養液。 用0.25% (w/) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清(血清會抑制胰酶的活性)。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養箱內約5分鐘，直到細胞全部脫落。 加6-8毫升培養液，用移液器把細胞吹散。 加適量的細胞到新的培養器皿中。(以1：2到1：4為宜，傳代期間培養液2-3天更換1次)

凍存：95%培養液+5%DMSO凍存于液氮。

293A 比較有意思了，是293中后來又建的細胞亞株，這個A是adhere的意思，就是說293傾向于形成單層細胞(monolayer)，它比293好的地方是在做計算病毒數量的空斑試驗(plaque assay)293A是均勻的一層，沒有細胞重疊和細胞空隙(hole)，就這個意思，這個A所對的是293S(suspension).液氮罐

293T細胞表達 E1A蛋白，S40大T抗原，含有S40復制起始點與啟動子區的質粒可以復制。

293FT細胞能制造高滴度的慢病毒。293A細胞來源于人腎纖維母細胞，組成性表達 E1A 和 E1B 蛋白。

QBI-293A細胞培養

293A 細胞來源于一個用作空斑測定的亞克隆，具有易使用和易轉染的特性。該細胞株對于高細胞密度很敏感，當細胞超過70%匯合時，一些細胞可能會丟失它們的表型。若細胞密度持續在70%以下，QBI-293A細胞則能連續培養3~4個月維持原有細胞特性。若以購買得到的293作為**代，則30代內能得到**結果。一旦到了30代，**復蘇一管細胞開始新的培養。所以，我們建議你在收到細胞后應盡快建立自己的QBI-293A細胞庫。

    5.1.1 QBI-293A細胞初始培養

1. 將凍存的一管QBI-293A細胞在37℃水浴輕輕晃動融化。

2. 融化后在超凈臺無菌條件下用70%乙醇將凍存管的蓋沿擦拭干凈。

3. 將細胞轉入15mL無菌離心管中，加入10mL DMEM 10%，600×g離心5分鐘使細胞沉淀。

4. 棄去上清。

5. 將細胞用10mL DMEM 10%重懸，輕輕打勻

6. 轉入75cm2培養瓶或100mm培養皿中培養。液氮罐

7. 在5% CO2孵箱中37℃培養過夜。

8. 第二天觀察細胞匯合率，若合適則可進行實驗，否則按5.1.2所述繼續培養。

5.1.2 QBI-293A細胞的維持培養和增殖

QBI-293A細胞必須按1:10到1:20傳代

1. 室溫下胰酶消化1~3分鐘使貼壁細胞脫落

2. 拍打培養瓶邊緣使細胞脫落，在倒置顯微鏡下觀察細胞是否變圓，是否已從培養瓶表面脫落。

3. 按需要用新鮮培養液稀釋細胞懸液，轉入新的培養瓶中。在5% FBS中，細胞倍增的時間是26小時，在10% FBS中稍短一些。

5.1.3 QBI-293A細胞的凍存

建立細胞庫時必須使培養的細胞匯合率低于50%，以保證亞克隆的特定表型。

1. QBI-293A細胞必須在含10%高質量FBS的DMEM中培養。

2. 將健康生長的QBI-293A細胞離心沉淀。

3. 以*小體積的DMEM 10%重懸細胞。

4. 用血球計數器進行細胞計數。

5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重懸細胞，細胞終濃度為1×106/mL。

6. 無菌操作將1mL細胞懸液轉入2mL凍存管中。

7. 將凍存管放入凍存盒中，-80℃儲存24小時。這一簡便措施可保持約1℃/分鐘的降溫速率，適于凍存細胞。

8. 第二天將凍存的細胞轉入液氮罐或-150℃冰箱中長期保存。QBI-293A細胞若正確凍存，則可在液氮罐中保存數年。液氮罐