將細胞保存在低溫-196℃液氮中的方法

細胞凍存是細胞生存的重要要領之一，使用凍存技能將細胞置于-196℃液氮中低溫生存，可以使細胞臨時離開生長狀態(tài)而將其細胞特性生存起來，如許在必要的時間再蘇醒細胞用于實行。并且適度地生存肯定量的細胞，可以防備因正在造就的細胞被污染或其他不測變亂而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。

除此之外，還可以使用細胞凍存的來購置、寄贈、互換和運送某些細胞。 細胞凍存時向造就基中參加掩護劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點低落，加之在遲鈍凍結條件下，細胞內水分透出，淘汰了冰晶形成，從而制止細胞毀傷。尺度冷凍速率開始為-1 到 -2℃/min，當溫度低于-25℃時可加快，到-80℃之后可直接投入液氮內(-196℃)。

現在常用的掩護劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

使用材料

儀器：液氮罐、凍存管(塑料螺口凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機等

試劑：0.25%胰酶、造就基、含掩護劑的造就基(即凍存液)

附：凍存液配制：造就基參加甘油或DSMO，使其終濃度達5-20%。掩護劑的種類和用量視差別細胞而差別。配好后4℃下生存。

操作步聚

1.消化細胞，將細胞懸液網絡至離心管中。

2.1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

3.沉淀加含掩護液的造就，計數，調解至5106/ml左右。

4.將懸液分至凍存管中，每管1ml。

5.將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口肯定要嚴，不然蘇醒時易出現爆裂。

6.貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。

7.按下列次序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。

注意：操縱時應警惕，以免液氮凍傷。液氮定期查抄，隨時增補，不克不及揮發(fā)潔凈，一樣通常30立升的液氮能用1～1.5月。