探究激光輔助孵化方法對胚胎解凍的影響

輔助孵化被用于輔助生殖相關技術已具有較長的時間，近幾年隨著顯微激光相關醫學的快速發展，激光系統由于具有快速、安全、準確等優點而被引入到輔助孵化，且已獲得較好的臨床效果。本文關于兩種激光輔助孵化方法對人類早期胚胎解凍后移植妊娠率的影響進行研究分析，所研究的結果報道如下。

1資料和方法

1.1一般資料 將2013年11月到2014年7月期間在我院接受凍融胚胎移植的160例患者作為臨床研究對象，按照隨機的原則分為兩組，每組80例，對照組中患者的年齡為27～40歲，平均年齡為(35.6±1.2)歲，該組患者子宮膜厚度平均值為(10.6±1.2)mm;研究組中患者的年齡為26～39歲，平均年齡為(35.3±1.0)歲，該組患者子宮膜厚度平均值為(10.7±1.6)mm。兩組排除了宮腔因素引起的不孕患者，且年齡、子宮內膜厚度相似，差異無統計學意義(P>0.05)，可以進行對比分析。

1.2方法

1.2.1 D3胚胎評級 參照胚胎分級1級:胚胎卵裂球大小均勻，形態規則，透明帶完整;胞質均勻清晰，沒有顆?，F象，碎片0%～5%;2級:胚胎卵裂球大小略不均勻，形態略不規則，胞質可有顆?，F象，碎片10%～20%之間;3級:胚胎卵裂球明顯大小不均，可有明顯的形狀不規則，胞質可有顆?，F象，胞質碎片21%～50%;4級:胚胎卵裂球大小嚴重不均，胞質可有嚴重顆?，F象，胞質碎片>50%。

1.2.2 冷凍胚胎 選擇(1)正常受精;(2)D1、D2、D3連續發育;(3)D2在2細胞以上，D3卵裂球數≥6個;(4)胚胎評級2級以上;解凍后胚胎移植的標準:胚胎解凍后有超過50%的卵裂球存活的胚胎認為胚胎解凍后復蘇，并用于移植。

1.2.3 胚胎慢速程序冷凍及解凍法 (1)胚胎冷凍:冷凍試劑盒Quinn’s胚胎冷凍配套培養基。操作步驟:胚胎于37℃移入Fl(冷凍稀釋培養基(含10%SPS的HEPES液))中，將胚胎在培養皿的不同區域反復沖洗，放置10min;移入F2(1.5MPPD溶液)中，于室溫平衡10min;移入F3(1.5MPPD+0.1M蔗糖溶液)中，裝入冷凍麥管并封好管口。將冷凍管置入已在起始溫度的程序冷凍儀中，開始冷凍從室溫(25℃)開始，以2℃/min的速度從室溫降至-8℃，當溫度穩定在-8℃時，進行植冰，并停留10min，之后以-0.3℃/min的速度從-8℃降至-30℃，再以10℃/min的速度從-30℃降至-150℃，投入液氮，并轉移至保存罐中。(2)胚胎解凍:解凍試劑盒Quinn’s胚胎解凍配套培養基。從液氮罐中取出麥管。在空氣中保持30～40s。投入37℃水浴，30s，直到冰*融化，然后將胚胎移入0.5M蔗糖解凍液中10min，再移至0.2M蔗糖解凍液中5min之后移入HEPES培養基(含10%SPS)中洗7次，后移至預平衡的卵裂培養基中待行輔助孵化。

1.2.4 玻璃化冷凍和解凍法 試劑為瑞典Vitrolife卵裂期胚胎玻璃化冷凍/解凍配套培養基。按照試劑盒說明進行冷凍及復蘇。(1)胚胎冷凍:所有的操作均在37℃熱臺上進行，把胚胎放入基礎液(不含冷凍保護劑)里平衡5～10min，然后將胚胎移入以乙二醇作為冷凍保護劑的培養基中2min，后在含有丙二醇、聚蔗糖和蔗糖為冷凍保護劑的冷凍液中平衡，30s內將胚胎移入低溫冷凍載體(瑞典Vitrolife封閉式載體)上并轉移入液氮中保存。(2)胚胎解凍:把冷凍載體從液氮中取出，然后迅速放入Warm1里10～30s后移入Warm2中1min后，再移入Warm3中平衡2min，后將胚胎置入基礎液中平衡5min，后移入預先平衡的卵裂培養基中等待行輔助孵化。

1.2.5 輔助孵化 顯微激光操作系統。對照組進行激光透明帶打孔輔助孵化，選取胚胎卵周隙的大位置持續的以2～3ms的激光能量進行激光打孔將部分胚胎透明帶切除掉，需保證中心部分*的穿透透明帶，盡量避免傷害到胚胎細胞，并將胚胎移到培養液滴中置于培養箱保存以等待進行移植;研究組進行激光透明帶削薄輔助孵化，選取胚胎卵周隙的大位置以4～6ms的激光能量將削薄1/4左右的胚胎透明帶，削掉約50%～80%的透明帶厚度，并防止穿透透明帶，將胚胎移到培養液滴中置于培養箱保存等待進行移植。對對照組80例進行激光透明帶打孔輔助孵化，對研究組80例進行激光透明帶削薄輔助孵化，并且每組均有40例為程序冷凍、40例為玻璃化冷凍。將經激光輔助孵化后的卵裂期胚胎在腹部B超的指導下移植到患者的宮腔，并于移植后對患者使用或者HCG進行黃體支持。

1.3統計學分析

使用統計學軟件SPSS17.0對數據進行處理，計量資料使用(x-±s)表示，采用成組t檢驗，計數資料用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。